Všeobecné

Převod embryí v Mares

Převod embryí v Mares

Embryo transfer je technika asistované reprodukce, pomocí které je embryo přeneseno z dělohy dárcovské klisny do dělohy recipientní klisny, která přinese těhotenství do konce. Embryo je obvykle získáno z dárcovské klisny výplachem dělohy (mytí) přibližně 6 až 8 dnů po ovulaci. Embryo je potom umístěno do dělohy synchronizované recipientní klisny.

Výhody

  • Cenná klisna může produkovat více než jedno hříbě za sezónu.
  • Klisny mohou soutěžit při výrobě hříbat.
  • Mladé, geneticky cenné klisny mohou začít produkovat hříbě před dosažením fyzické zralosti nebo během tréninku.
  • Ve věku klisny neschopné nést hříbě samy kvůli patologii založené na biopsii dělohy může pokračovat produkce hříbat.
  • Klisny s tělesným postižením zabraňující těhotenství nebo hříbě, jako je trhání břišních svalů nebo staré pánevní fraktury, mohou stále produkovat potomstvo.

    Nevýhody

  • Tento postup je nákladný.
  • Některá chovatelská sdružení uplatňují omezení nebo zákaz.
  • Provádění přenosu embryí u klisen vyžaduje specializovaný výcvik, a proto ne všechna koňská zařízení nebo praktičtí lékaři jsou připraveni tuto službu nabídnout.

    Úspěch tohoto postupu závisí na schopnosti řídit některý z následujících faktorů:

  • Inherentní plodnost dárcovské klisny, kterou nelze kontrolovat. V mnoha případech je navíc neplodnost důvodem, proč se některé klisny stávají kandidáty na přenos embryí.
  • Vlastní plodnost klisny příjemce. Tyto klisny by měly být vybírány na základě mladého věku a normálního reprodukčního traktu.
  • Při provádění přenosu embryí by mělo být vhodné řízení chovu nebo načasování.
  • Technika regenerace a přenosu embryí. Zkušenost veterinárního lékaře hraje důležitou roli v úspěšnosti postupu.
  • Stupeň synchronizace dárce a příjemce. Dárcovské a recipientní klisny jsou synchronizovány s použitím hormonů; těsná synchronizace je důležitá pro zajištění toho, aby se embryo přeneslo do vhodného děložního prostředí.

    Zařízení pro přenos embryí

    Spuštění programu přenosu embryí vyžaduje založení specializované laboratoře. Zařízení na převoz embryí je komerčně dostupné od většiny společností prodávajících chovatelské potřeby koňovitých. Kromě obvyklého vybavení používaného pro rutinní asistované šlechtění, jako je ultrazvuk, je třeba následující:

  • Foley katétry pro vypláchnutí dělohy dárce. Jedná se o speciální typ katétru, který se používá k propláchnutí dělohy dárcovské klisny pro získání embrya. Balón na jeho konci umožňuje uložení katétru do děložního hrdla klisny, což zabraňuje ztrátě tekutiny během proplachovacího postupu.
  • Extra hadičky a konektory, které jsou připojeny ke konci katétru Foley k zavedení a propláchnutí tekutiny z dělohy klisny.
  • Speciální filtry pro získání embrya z proplachovací tekutiny.
  • Disekční mikroskop pro hledání embrya.
  • Sterilní kultivační misky, kapilární skleněné pipety a různé laboratorní náčiní.

    Proplachovacím médiem, které se nejčastěji používá pro přenos embryí, je Dulbecco fosfátový pufrovaný fyziologický roztok (DPBS) doplněný 10% fetálním telecím sérem a antibiotiky. Toto médium se také používá k mytí a přenosu embrya do dělohy příjemce. Médium lze zakoupit v kapalné nebo práškové formě a rekonstituovat v laboratoři. Jako alternativu k DPBS, která je drahá, někteří praktikové místo toho používají řešení s lakovaným vyzváněním.

    Před pokusem o regeneraci embryí by se mělo veškeré nádobí a média zahřát na tělesnou teplotu v inkubátoru, aby nedošlo k šoku na embryo. Veškeré vybavení by mělo být před použitím buď jednorázové nebo řádně omyté a sterilizované. K mytí zařízení pro přenos embryí by neměly být používány žádné detergenty ani dezinfekční prostředky, protože mohou zanechávat zbytky, které by mohly ohrozit životaschopnost embrya. Zařízení se promyje pouze teplou vodou z vodovodu a poté se důkladně opláchne destilovanou vodou. Opakovaně použitelné katétry, hadičky a filtry by měly být před použitím sterilizovány plynem.

    Samostatné katétry Foley by měly být vyhrazeny pro postupy pro získávání embryí a nemíchány s těmi, které se používají k výplachu dělohy klisen.

    Výběr příjemců pro přenos embryí

    Je vhodné investovat čas a peníze do výběru optimálních příjemců, protože by bylo zbytečné investovat zdroje a odborné znalosti do chovu dárcovské klisny a do obnovy embrya a poté jej umístit do dělohy klisny, která nemohla nést hříbě období. Všechny klisny zakoupené za účelem získání příjemců pro program přenosu embryí by proto měly být podrobeny kompletní zkoušce správnosti chovu. Všechny klisny, které se dostanou do programu příjemce, by měly při hodnocení ve vzorku biopsie projít všemi aspekty BSE a mít zdravé endometrium (výstelku dělohy).

    Důležitý je také věk příjemců. Je pravděpodobnější, že zralá, ale relativně mladá klisna (stará 5 až 8 let) bude schopna nést hříbě. Klisny koupené jako příjemci se často získávají prostřednictvím veřejných dražeb a věk není znám. Člověk by měl mít jistotu při hodnocení věku hodnocením zubů.

    V ideálním případě by klisny v přijímajícím programu měly být vybírány podle velikosti těla podobné nebo mírně větší, než je velikost plemene dárcovské klisny. Je známo, že velikost klisny ovlivní velikost hříbě, bez ohledu na genetický vstup dárce.

    Konečně je dobré vybrat si klisny s dobrou predispozicí nejen proto, že se s nimi bude během procesu snáze manipulovat, ale také proto, že mohou udělat lepší matky. V tomto ohledu by mělo být ideální znát pozadí klisny a vybrat si klisnu, která v minulosti bezohledně žila. Nejenže byste věděli jistě, že klisna je schopna nést hříbě, které je možné nazvat, ale také mateřství klisny. Bohužel, pokud není poskytnuta klientem, je minulost příjemných klisen často neznámá.

    Synchronizační protokol pro dárce a příjemce

    V závislosti na osobních preferencích a zkušenostech se používá mnoho synchronizačních protokolů pro dárce a příjemce. Hormony jsou poskytovány dárci a příjemcům, aby manipulovali se svým cyklem estrusů s cílem, aby se všichni všichni současně zahřívali. Tato léčba se může lišit od poskytnutí klisny jedinému výstřelu prostaglandinu, až po umístění klisen do úplného plánu léčby progesteronovými a estrogenovými výstřely.

    Ačkoli je těžkopádná, řada progesteronových / estrogenových snímků poskytuje nejlepší synchronizaci mezi dárcem a příjemcem. Stručně řečeno, protokol sestává z denní injekce kombinace progesteronu a estrogenu po dobu 8 až 10 dnů (150 mg progesteronu plus 10 mg estradiolu-17b na dávku). To potlačuje hormony klisny a po ukončení léčby by se většina klisen měla zahřát za 3 až 5 dní. Protože některé klisny mohou během léčby ovulovat, je na konci série progesteron-estrogen obvykle podáván výstřel prostaglandinu pro lepší synchronizaci.

    Perorální progestageny uváděné na trh, aby se klisny udržovaly mimo teplo, nefungují také pro synchronizační protokoly.

    Jakmile je dárce a příjemci zahřátí a dárcovská klisna je vyšlechtěna na příslušného hřebce, může být ve všech klisen vyvolána ovulace tím, že jim bude podán snímek lidského chorionického gonadotropinu. To zajistí užší synchronizaci ovulace mezi dárcem a příjemcem. Příjemce je ideální, pokud ovulovala ve stejný den nebo jeden den po dárci. Méně ideální příjemci jsou ti, kteří ovulují jeden den před nebo po datu ovulace dárce.

    Bohužel i ty nejlepší synchronizační protokoly mohou selhat a dárce a příjemci nemusí vždy přijít do synchronizovaného tepla a ovulovat podle očekávání. To je dobrý důvod, aby pro každou dárcovskou klisnu bylo vždy k dispozici více než jednoho příjemce. Doporučuje se alespoň dva příjemci na dárce, tři by byli ideální.

    Vedení chovu dárce Mare

    Prvním omezujícím faktorem úspěchu programu přenosu embryí je to, že dárcovská klisna musí otěhotnět. Je proto nezbytné praktikovat dobré řízení chovu dárcovské klisny.

    Dárcovská klisna může být chována s čerstvým nebo přepravovaným chlazeným spermatem. Je důležité, aby sperma bylo dobré kvality a aby měl hřebec dobře prokázané míry těhotenství. Je zřejmé, že ideální hřebec pro klisnu není vždy vybrán s ohledem na jeho potenciál plodnosti. Je však třeba se vyhnout starým a subtilním hřebcům, aby se zabránilo zavedení dalšího faktoru, který může bránit úspěchu programu přenosu embryí. Ze stejného důvodu by se nemělo používat zmrazené a rozmrazené sperma.

    Optimální řízení chovu spočívá v chovu klisny během estrasu co nejblíže ovulaci. V ideálním případě by měl být reprodukční trakt dárce a příjemců denně vyšetřen palpací a ultrazvukem na konečník, aby se zjistil optimální čas pro chov dárce a posoudil synchronnost s příjemci.

    Při chovu musí být dárci podána injekce lidského chorionického gonadotropinu, aby se vyvolala ovulace, a příjemci jsou léčeni podobným způsobem (ale nikoli vyšlechtěni) pro přísnější synchronizaci ovulace.

    Ovulace by měla být vždy potvrzena ultrazvukem. Den ovulace se považuje za „den 0“ a děloha kobylky klisny je obvykle proplachována 7. den po ovulaci.

    Postup odběru embryí

    Zotavení embryí z dárcovské klisny se obvykle provádí v den 7 po ovulaci. Nejprve se klisna zkontroluje palpací a ultrazvukem na konečník, aby se zjistil tón a vzhled dělohy. Kobyla, která je těhotná, bude mít pravděpodobně velmi tónovanou homogenní dělohu, uzavřený děložní čípek a v děloze nebude žádná tekutina, jak je vizualizováno ultrazvukem. V této době je embryo příliš malé na to, aby bylo vidět na ultrazvuku.

    Kobyla je připravena k regeneraci embryí očištěním perineální oblasti (vulva, konečník a hýždě) třením povidon jodem (Betadine) a po každém čištění důkladně opláchněte vodou. Po velkorysém opláchnutí se oblast suší čistými papírovými ručníky.

    Osoba provádějící regeneraci přenosu embryí by měla nosit čisté palpační rukávy a sterilní rukavice a pro mazání by měla být použita sterilní želé na vodní bázi. Jedna ruka je zavedena do klisny klisny, aby prošla katétrem Foley skrze děložní hrdlo a do těla dělohy. Pak je balón katétru nafouknut vzduchem pomocí malé stříkačky, a tak je bezpečně uložen do děložního čípku, aby se zabránilo ztrátě tekutiny během vyplachování dělohy.

    Provádění postupu odběru embryí vyžaduje alespoň dva lidé, jeden drží katétr v traktu klisny a asistent pomáhá při zavádění a regeneraci tekutin. Jeden litr tekutiny se gravitací vlévá do dělohy klisny, poté se znovu získá do velkého skleněného válce nebo přímo prochází filtrem, aby zachytil embryo. Toto se opakuje třikrát.

    Některá tekutina by měla být udržována uvnitř regeneračního filtru, aby nedošlo k vyschnutí embrya. Po dokončení regenerace se tekutina uvnitř filtru dekantuje do Petriho misky. Hledání embrya se provádí při zvětšení disekčním mikroskopem.

    Postup přenosu embryí

    Pokud se zotavení provádí v den 7 po postovulaci, embryo by mělo být ve stadiu blastocysty a zkušený operátor by jej měl snadno vizualizovat pod pitevním mikroskopem.

    Jakmile je zjištěno, embryo se promyje sterilním DPBS 10% fetálním telecím sérem. Embrya lze zpracovat pomocí 0,25 ml francouzských spermatických zmrazovacích brčka nebo skleněných pipet připojených k gumové baňce nebo k malé tuberkulinové injekční stříkačce.

    Embryo se běžně transcervikálně přenáší, tj. Děložním hrdlem klisny, jako by provádělo umělé oplodnění. Pro tento účel:

  • Vybraný příjemce je připraven k převodu zabalením a uvázáním jejího ocasu. Její děloha musí být zkontrolována na tón a známky tekutin. Embryo by nikdy nemělo být přeneseno do klisny, která má tekutinu v děloze.
  • Poté se perineální oblast klisny příjemce důkladně vymytí, jak je vysvětleno pro dárce.
  • Embryo může být naloženo do inseminační pipety připojené k 5 ml injekční stříkačce Air-Tite. Nejprve se do stříkačky naplní asi 1 ml vzduchu, pak se do pipety naloží tři malé kapsy média oddělené kapsami vzduchu, přičemž tekutinová kapsa uprostřed obsahuje embryo.
  • Osoba provádějící postup přenosu by měla nosit chirurgickou sterilní rukavici přes čistou plastovou objímku ramene. Pipeta se vloží do vagíny a opatrně prochází děložním hrdlem. Jakmile postupuje do těla dělohy, píst stříkačky je tlačen dopředu a embryo je injikováno do dělohy.
  • Přibližně 7 dní po převodu by měla být klisna příjemce vyšetřena na těhotenství.

    Další možností je provedení chirurgického přenosu embryí. To se provádí u sedativního příjemce ve stoje pomocí boku řezu, který umožňuje exterizaci děložního rohu. Při chirurgickém přenosu embryí není zřejmá výhoda a postup je pro příjemce klisnu traumatičtější.

    V některých případech se majitelé nebo odborníci provádějící přenos embryí rozhodnou, že nebudou mít příjemci embryí pro danou dárcovskou klisnu. Tím se zabrání problémům s nákupem, kontrolou a údržbou příjemců, jakož i nákladům a práci spojenou se synchronizací. V tomto případě může být odebrané embryo odesláno do doporučovacího zařízení, které má v daném okamžiku k dispozici mnoho příjemců k přenosu. Nevýhody této alternativy jsou rizika spojená s přepravou embrya a také to, že míra těhotenství může být mírně snížena, pokud se embryo neprodá ihned po odběru.

    Pro přepravu jsou embrya balena do sterilní lahvičky obsahující komercionalizované médium Hams F-10, které je pufrováno rozptýlením směsi 90% dusíku, 5% kyslíku a 5% oxidu uhličitého. Připravené médium lze objednat z předávacího zařízení těsně před provedením postupu regenerace embrya. Toto médium je také doplněno fetálním telecím sérem a antibiotiky.

    Po odebrání a promytí se embryo umístí do 3 ml sterilní plastové lahvičky obsahující ekvilibrované teplé médium, a to se preventivně umístí do 50 ml média obsahující centrifugační zkumavku.

    50 ml zkumavka je zabalena do ekvitaineru pro vychlazenou přepravu.

    Zabalená embrya by měla být přepravována leteckou společností nebo kurýrní službou přes noc a měla by být převedena, jakmile se dostanou k převáděcímu zařízení, nejlépe do 24 hodin po zjištění.